DSG型生物信息红外肝病治疗仪促进小鼠肝脏微循环的实验研究
发布时间：2011-02-25 浏览次数：10468
田甜 徐列明
【摘要】目的 研究DSG型生物信息红外肝病治疗仪（BILT肝病治疗仪）对小鼠肝脏微循环的影响。方法 将40只SPF小鼠造模后随机均分为未照射模型组、冷光源照射模型组、红外线照射模型组和BILT肝病治疗仪照射模型组，另取20只正常小鼠作为对照。每组分别以激光多普勒血流仪测定肝脏血流量并以显微活体视频技术观察肝脏微循环血流速度，同时进行肝脏病理学检查和血流清生化学检查。结果 BILT肝病治疗仪照射模型组肝脏平均血流灌注量与未照射模型组比较明显增加（P=0.004），而冷光源、红外线照射模型组与未照射模型组比均无明显增加血流量作用（P=0.713和0.465）；未照射正常组较未照射模型组小鼠肝脏微血管内红细胞平均流速快,差异有统计学意义(P=0.001)；BILT肝病治疗仪照射模型组肝脏微循环平均流速较未照射模型组、冷光源照射模型组和红外线照射模型组的流速也有所增加，差异有统计学意义(P=0.004、0.020和0.030)。BILT肝病治疗仪照射模型组AST活性较未照射模型组明显降低（P=0.027），该组羟脯氨酸（Hyp）平均含量低于未照射模型组，但差异无统计学意义(P=0.433)。结论 BILT肝病治疗仪可改善肝纤维化小鼠肝脏的微循环并降低肝纤维化小鼠血清AST活性，改善肝脏病理状态。
【关键词】 纤维化；肝脏微循环；红外线；活体显微视频技术
DSG biological information infrared liver disease therapy instrument improves liver microcirculation in mice TIAN Tian ,XU Lie-ming. Institute of Liver Disease, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203,China
Corresponding author: XU Lie-ming, Email: xulieming@shutcm.edu.cn
【Abstact】 Objective To investigate the effect of DSG biologic information infrared liver disease therapy instrument（BILT liver disease therapy instrument） on liver microcirculations in mice. Methods Liver fibrosis was induced in 40 SPF mice which were randomized into 4 groups:without irradiation group, cold light irradiation group,infrared light irradiation group and BILT group（10 in each group）.Twenty
healthy mice were taken as the control. Liver blood flow of each group was observed by laser-Doppler flow instrument, and blood flow rate of liver microcirculation in each group was observed by intravital microscopy. Pathological examination and serum biochemistry were also performed. Results In fibrosis mice , the liver blood flow in average of BILT group was higher than that of without irradiation group (P =0.004),while comparing with without irradiation group there were no significant differences in liver blood flows of the cold light irradiation group and infrared light irradiation group(P =0.713 and 0.465). Red blood cell velocity of microvessels in average of the healthy group (without irradiation) was higher than that in the without irradiation group of fibrosis mice (P =0.001),and it in the BILT
DOI：10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2009.01.007
基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）部分资助项目（2006CB504800）；上海市重点学科建设资助项目（Y0302）；上海市教育委员会E-研究院建设计划项目部分资助项目（E03008）
作者单位：201203 上海中医药大学肝病研究所（田甜、徐列明）；上海中医药大学附属曙光医院肝硬化科
上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室 上海市高校中医内科学E-研究所（徐列明）
通讯作者：.徐列明，Email:xulieming@shutcm.edu.cn
group（fibrosis mice）was also higher than those in other groups of fibrosis mice（P =0.004,0.020 and 0.030）.For fibrosis mice, the averageAST in BILT group was lower than that in the without irradiation group(P =0.027),and the difference in hydroxyproline（Hyp）levels between the groups was not of statistical significance（P =0.433）.
Conclusion BILT liver disease therapy instrument can improve the liver microcir-culation, reduce AST
level and improve liver pathological state in mouse with fibrosis.
【Key words】 Fibrosis; Liver microcirculation;Infrared rays; Intravital microscopy
应用激光多普勒技术和显微活体视频技术，观察以活血化瘀原理研制的DSG型生物信息红外肝病治疗仪（BILT肝病治疗仪）对正常小鼠和肝纤维化模型小鼠肝脏微循环的影响，从“活血”改善微循环角度诠释BILT肝病治疗仪的作用。
1材料和方法
1.1 材料 昆明种雄性小鼠60只，体质量(30±5)g，SPF级，由上海中医药大学实验动物中心提供；四氧化碳(CCl4)和橄榄油（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC，美国sigma公司）。PowerLab/4sp 激光多普勒血流仪和Chart 5.0 (Powerlab/4sp)记录和分析软件（澳大利亚ADI公司）；医用冷光源（浙江医学仪器厂）；红外灯（江苏海门医疗器械公司）； BILT肝病仪（杭州大力神医疗器械有限公司）；MT-2荧光倒置显微镜、CCD显微摄像和录像系统（Olympus 公司）。
1.2. 方法
1.2.1 造模 参照余万桂[1]的方法建立小鼠肝纤维化模型：40只小鼠用20％CCl4以5mg/kg颈部皮下注射，每5天注射1次，共6周。
1.2.2 分组与准备 小鼠被随机分为正常组（20只）和造模组（40只）。正常组小鼠再随机分为未照射正常组和BILT肝病治疗仪照射正常组，每组10只。造模组小鼠造模后随机分为未照射模型组、冷光源照射模型组、红外线照射模型组和BILT肝病治疗仪照射模型组，每组10只。接受照射的小鼠分别装入自制小铁笼内，露出腹部肝脏投影区，距相应光源15cm，每天照射1次，每次15min。照射疗程为4周。疗程结束后，各组随机分出5只进行激光多普勒血流量测定，余下5只以显微活体视频技术观察肝脏微血管和肝窦内血流速度。
1.2.3 激光多普勒血流仪测定肝脏微循环平均血流灌注量用Chart 5.0 (Powerlab/4sp)记录和分析软件记录小鼠肝脏平均血流灌注量，每只小鼠记录10min。取5min后平稳段数据计算其平均值，得到各组小鼠平均血流灌注量。
1.2.4.1 荧光标记的红细胞制备 参照参考文献[2] 中的方法。
1.2.4.2 活体动物测前准备 小鼠以2%戊巴比妥钠按2ml/kg剂量麻醉后，沿正中线剪开小鼠腹壁，拉出小鼠肝脏平铺于载玻槽玻片上，置Olympus倒置荧光显微镜下观察。
1.2.4.3 注射FITC标记红细胞并显微摄像设置拍摄像素为最小值，曝光时间为60ms，使拍摄速度达到最快。从下腔静脉注射FITC标记的红细胞0.05ml，在显微镜下找到合适的观察部位，然后切换到电脑上仔细观察微血管和肝窦内血流状况并数码录像，用视频处理软件比较各组间微循环血流速度的差异。
1.2.4.4 图象处理 用Image-pro plus 6.0软件处理视频图像，寻找直径在20mm以下微血管内合适的荧光标记的红细胞进行追踪。每个视频至少找出3个FITC标记红细胞的轨迹取平均值，保存和记录各轨迹数据及图象，本系统按最快10桢/s计算，通过追踪FITC标记红细胞的两桢图象之间流动的距离和时间计算其在微血管内的流动速率。
1.2.5 样本的采集与处理 用激光多普勒血流仪测定每组小鼠肝脏平均血流灌注量后，摘眼球采血，4℃下静置2h，离心半径9.4cm,3000r/min离心15min，取上清液分装于1.5ml离心管内，-70℃低温保存；动物采血处死后，取下肝脏切取约1.0cm´0.8cm´0.3cm大小肝组织，10%中性甲醛固定，24h后逐级酒精脱水，二甲苯透明，56℃石蜡包埋，4µm厚切片，用于HE和胶原染色。
1.2.6 肝脏组织学观察 按照本研究所制定的胶原纤维增生程度的半定量标准[3]，镜下观察各组肝组织胶原染色片，判断肝纤维化的程度。各肝组织样本进行胶原纤维染色后，用图象定量分析系统扫描，读取胶原染色阳性面积百分比，取每张切片5个视野的平均值，进行胶原纤维增生程度的半定量统计分析。
1.2.7 血清生化学检测 ALT和AST活性的检测采用赖氏法；Alb含量的测定采用溴甲酚绿法；TBil含量的测定采用苯甲酸钠—咖啡因比色法，上述检测均由曙光医院检验科完成。
1.2.8 肝组织羟脯氨酸（Hyp）测定 采用Jamall法[4]测定。
1.3 统计学方法 用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。定量资料的数据分析采用单因素方差分析(ANOVA)，结果以`X±S表示，定性等级资料的数据分析采用Ridit分析，统计检验水准a =0.05。
2 结果
2.1 BILT肝病治疗仪对肝纤维化小鼠肝脏微循环的影响
2.1.1 激光多普勒血流测定肝脏微循环平均血流灌注量 未照射模型组肝脏平均血流灌注量较未照射正常组略低，差异无统计学意义（P=0.679） BILT肝病治疗仪照射正常组的指标略高于未照射正常组，差异无统计学意义（P=0.142）；BILT肝病治疗仪照射模型组肝脏血流量与未照射模型相比明显增加（P=0.004），而其它光源作用于造模组后与未照射模型相比均无明显增加血流量作用(P=0.713和0.465)（表1）。
表1. 不同光源处理后各组小鼠肝脏平均血流灌注量（`X±S）
注： 与未照射模型组比，aP=0.0
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2.1.2 活体显微视频技术观测肝脏微循环流速
1.2.2.1 镜下观察 正常小鼠肝脏表面血管丰富，肝窦以肝小叶中央静脉为中心呈密集的树枝状分布于其周围，在2个肝小叶间，毛细血管相互吻合，血管边界清晰，血流向中央静脉流动（图1a）。各模型组与正常组小鼠肝脏微循环流速比较均明显减慢；BILT肝病仪照射模型组小鼠肝脏微循环流速虽也较正常组明显减慢，但比未照射模型组微循环流速快。各模型组小鼠均可见肝脏微血管数明显减少，肝小叶间微血管数稀疏，血管周围有小泡状透亮影，血管内可见少量标记的红细胞聚集和黏附（图1b）。
2.1.2.2 图象处理后的数据分析 正常组及造模组视频处理后图像见图2，各组小鼠肝脏内微血管内红细胞流速比较见表2。未照射正常组与未照射模型组小鼠肝脏内微循环流速比较差异有统计学意义（P=0.001）；冷光源照射模型组、红外线照射模型组与未照射模型组小鼠肝脏微血管红细胞流速比较差异无统计学意义（P=0.909和0.925），BILT肝病治疗仪照射模型组微血管内红细胞流速较未照射模型组、冷光源照射模型组、红外线照射模型组增加，差异均有统计学意义（P=0.004、0.020和0.030）。
注:(1a)正常小鼠肝脏微血管，（1b）模型小鼠肝脏微血管，箭头所示为荧光标记的红细胞；
(2a)正常小鼠，(2b)模型小鼠，图中直线所示为红细胞流动轨迹。
图1 正常小鼠和模型小鼠肝脏微血管Х200 图2 正常组和模型组小鼠肝脏微循环视频处理后的图像及轨迹
Fig1 Hepatic microvasculars of healthy mice and fibrosis mice Х200
Fig2 Video images and tracks of hepatic microciculation in healthy and fibrosis mice
表2. 不同光源照射后小鼠肝脏微血管内红细胞流速（`X±S ）
Table2 Red blood cell velocity of hepatic microvessels of mice treated by different light sources（`X±S ）
.2 各组小鼠肝脏病理学观察
2.2.1 大体观察 造模结束时模型小鼠较正常组小鼠明显萎靡、毛发杂乱。正常组和BILT肝病治疗仪照射正常组小鼠肝脏表面光滑、质软、色红褐；未照射模型组及接受不同光源照射的模型组小鼠肝脏均可见不同程度的肿胀，肝表面呈颗粒状，质较硬，色暗。
2.2.2 肝组织HE染色观察 未照射正常组和BILT肝病治疗仪照射正常组小鼠的肝小叶结构正常，肝细胞在中央静脉周围呈放射状排列，无明显变性坏死或炎性细胞浸润；各模型组小鼠肝细胞均有不同程度的细胞质疏松；未照射模型组镜下可见中央静脉聚集，出现“辐辏现象”；冷光源照射模型组有少量散在肝细胞核空泡变性，肝细胞细胞质疏松明显；红外照射模型组大量肝细胞细胞质疏松；BILT肝病治疗仪照射模型组仅有少量肝细胞细胞质疏松（图3）。
2.2.3 肝组织胶原纤维增生的半定量分析 正常组小鼠肝组织无纤维组织增生；各模型组小鼠肝组织汇管区扩大结缔组织增生，向小叶内伸展，形成不完全间隔及个别菲薄的完全间隔（图4）。肝组织胶原纤维增生的半定量分析显示：未照射模型组与未照
射正常组比较差异有统计学意义（P=0.06），BILT肝病仪照射模型组5例评级均为Ⅱ
注：（a）未照射正常组；（b）BILT肝病治疗仪照射正常组；（c）未照射模型组；（d）冷光源照射模型组；（e）红外线照射模型组；（f）BILT肝病治疗仪照射模型组
图3. 不同光源照射后小鼠肝组织炎性反应变化HEХ200
Fig3 Inflammation in liver tissues of mice treated by different light sources HE ×200
图4不同光源照射后各组小鼠肝组织胶原纤维沉积变化 天狼猩红染色´100
Fig4 Collagenous fibre deposit in liver tissues of mice treated by different light sources
Sirius red stain´100
级，但与未照射模型组比较差异无统计学意义，接受不同光源照射模型组之间比较差异无统计学意义（表3）。
表3 不同光源照射小鼠的胶原纤维增生情况（Ridit分析）
注：与未照射正常组比较，aP=0.006
2.2.4 胶原纤维增生程度图像处理分析 未照射模型组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射正常组比较明显增大(P=0.007)；BILT肝病治疗仪照射模型组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射模型组明显减小（P=0.001）；冷光源照射模型组、红外线照射模型组的小鼠胶原纤维染色的阳性面积比则与未照射模型组无明显差别（P=0.480和0.133）（表4）。
表4 组小鼠肝组织纤维增生的半定量分析（`X±S ）
注：与未照射正常组比,a P=0.007；与未照射模型组比较, bP=0.001
2.3 血清生化检测结果
2.3..1 各组小鼠血清ALT、AST、TBiL及Alb值
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.2 各组小鼠肝脏病理学观察 2.2.1 大体观察 造模结束时模型小鼠较正常组小鼠明显萎靡、毛发杂乱。正常组和BILT肝病治疗仪照射正常组小鼠肝脏表面光滑、质软、色红褐；未照射模型组及接受不同光源照射的模型组小鼠肝脏均可见不同程度的肿胀，肝表面呈颗粒状，质较硬，色暗。 2.2.2 肝组织HE染色观察 未照射正常组和BILT肝病治疗仪照射正常组小鼠的肝小叶结构正常，肝细胞在中央静脉周围呈放射状排列，无明显变性坏死或炎性细胞浸润；各模型组小鼠肝细胞均有不同程度的细胞质疏松；未照射模型组镜下可见中央静脉聚集，出现“辐辏现象”；冷光源照射模型组有少量散在肝细胞核空泡变性，肝细胞细胞质疏松明显；红外照射模型组大量肝细胞细胞质疏松；BILT肝病治疗仪照射模型组仅有少量肝细胞细胞质疏松（图3）。 2.2.3 肝组织胶原纤维增生的半定量分析 正常组小鼠肝组织无纤维组织增生；各模型组小鼠肝组织汇管区扩大结缔组织增生，向小叶内伸展，形成不完全间隔及个别菲薄的完全间隔（图4）。肝组织胶原纤维增生的半定量分析显示：未照射模型组与未照 射正常组比较差异有统计学意义（P=0.06），BILT肝病仪照射模型组5例评级均为Ⅱ
注：（a）未照射正常组；（b）BILT肝病治疗仪照射正常组；（c）未照射模型组；（d）冷光源照射模型组；（e）红外线照射模型组；（f）BILT肝病治疗仪照射模型组 图3. 不同光源照射后小鼠肝组织炎性反应变化HEХ200 Fig3 Inflammation in liver tissues of mice treated by different light sources HE ×200
图4不同光源照射后各组小鼠肝组织胶原纤维沉积变化 天狼猩红染色´100 Fig4 Collagenous fibre deposit in liver tissues of mice treated by different light sources Sirius red stain´100 级，但与未照射模型组比较差异无统计学意义，接受不同光源照射模型组之间比较差异无统计学意义（表3）。
表3 不同光源照射小鼠的胶原纤维增生情况（Ridit分析）
注：与未照射正常组比较，aP=0.006 2.2.4 胶原纤维增生程度图像处理分析 未照射模型组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射正常组比较明显增大(P=0.007)；BILT肝病治疗仪照射模型组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射模型组明显减小（P=0.001）；冷光源照射模型组、红外线照射模型组的小鼠胶原纤维染色的阳性面积比则与未照射模型组无明显差别（P=0.480和0.133）（表4）。
表4 组小鼠肝组织纤维增生的半定量分析（`X±S ）
注：与未照射正常组比,a P=0.007；与未照射模型组比较, bP=0.001
2.3 血清生化检测结果 2.3..1 各组小鼠血清ALT、AST、TBiL及Alb值 未照射正常组与模型组比较ALT、AST活性及TBil、Alb含量差异无统计学意义；BILT肝病治疗仪照射模型组的AST活性较未照射模型组明显降低，差异有统计学意义（P=0.027）；冷光源照射模型组和红外线照射模型组AST活性均与未照射模型组无明显差别；各模型组间ALT活性及TBil、Alb含量无明显差异。（表5） 2.3.2 各组小鼠肝组织Hyp含量 未照射模型组的Hyp平均含量比未照射正常组增加，差异有统计学意义（P=0.007），说明造模是成功的。BILT肝病治疗仪照射模型 表5 各组肝肝纤维化小鼠血清ALT、AST活性及Tbil、Alb含量的影响（`X±S ）
注：与未照射模型组比，aP=0.027 组的Hyp平均含量比未照射模型组肝组织稍低，但差异无统计学意义，冷光源照射模型组、红外照射模型组和BILT肝病仪照射模型组之间Hyp含量的差异也无统计学意义（表6）。 表6 不同光源对肝纤维化小鼠肝组织Hyp含量的影响（`X±S ）
注：与未照射模型组比，aP=0.007 3 讨论 肝纤维化是各种慢性肝炎病理变化的重要特征之一,是各种慢性肝炎向肝硬化发展的必经病理生理阶段。饶娴宜等[5]于20世纪80年代提出“肝微循环障碍是病毒性肝炎发病的病理生理基础”，认为在各型肝炎的整个过程中均存在着不同程度的肝脏微循环障碍，改善微循环是治疗病毒性肝炎的重要环节。鉴于肝纤维化过程中肌成纤维细胞收缩与微循环障碍的形成和发展有着密切联系，因此通过改善肝脏微循环是抗肝纤维化治疗的重要措施，对于逆转肝纤维化具有重要的临床意义。 国内学者经过多年研究，把中医的“瘀血”与肝纤维化联系在一起，认为肝纤维化是“瘀”，因此“活血化瘀”可以达到抗肝纤维化的目的[6]。如果把活血化瘀作用限定在促进血液循环方面，那么热能和机械能等物理作用也有类似的活血化瘀作用。BILT肝病治疗仪的治病原理符合中医的活血化瘀机制，用红外线透射组织，使肝区部位获得红外波能量，改善肝细胞膜的通透性，使肝血窦的血流量增加。 为观察BILT肝病治疗仪对肝纤维化的治疗作用，本文用CCl4诱导小鼠复制肝纤维化动物模型。与未照射正常组比较，未照射模型小鼠的AST活性和TBil含量有所升高但差异不显著，同时应用多普勒技术看不到未照射模型组小鼠的肝脏平均灌注量有明显变化。这些阴性结果的产生可能与选择的小鼠品系有关。 本实验显示，肝纤维化模型小鼠接受BILT肝病治疗仪照射后，肝脏病理改变较轻，仅有少量肝细胞变性，胶原显微半定量分析显示肝纤维化程度5例全为II级，为造模各组中最轻者，但差异无统计学意义，可能与样本量少有关。胶原纤维增生半定量分析显示，BILT肝病治疗仪照射模型组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比较未照射模型组明显减小，差异有统计学意义。该组肝Hyp含量在造模各组中也是最低，虽与其他组别Hyp含量无统计学差异，但提示具有改善肝纤维化的趋势。BILT肝病治疗仪可明显降低肝纤维化模型小鼠血清AST活性，与未照射模型组比较有明显差异。肝纤维化小鼠经BILT肝病治疗仪照射后，肝脏微循环流量和流速明显增加，较未照射模型组差异显著，但未发现其对正常组产生影响。冷光源和红外线照射肝纤维化小鼠，无论是肝脏病理、肝脏各生化指标，还是肝脏微循环，其产生的影响和未照射模型组相比差异均无统计学意义。 近年来，非药物疗法在国内外受到广泛关注，其优点在于用物理学原理治疗肝脏疾病，避免了药物在代谢过程中对肝、肾潜在的不良反应。BILT肝病治疗仪作为辅助治疗手段，操作简单，使用方便，可避免因使用过多药物而增加对肝脏的负担。该仪器安全性好，与患者治疗部位无直接接触，避免了交叉感染的可能性，将是一种有前途的非药物治疗肝病方法，值得临床推广。 志谢 本文采用的活体显微视频技术得到深圳南山医院齐柯主任的帮助，特表谢意。 参 考 文 献 [1]Yu WG, Zhang HW, He SR. Effects of panax notoginseng saponins on TGF-ß1 and IL-1 in mice serum with liver fibrosis. Shizhen Guoyi Guoyao,2006,17(1):54-55(in chinese) 余万桂，张恒文，贺尚荣，三七总皂苷对肝纤维化小鼠血清中转化生长因子-ß1及白介素-1的影响。时珍国医国药，2006,17(1):54-55 [2] Zheng XX, Chen HF.Microcirculation blood flow quantitative measurement system[D].Zhejiang University,2002(in chinese) 郑筱祥，陈鸿峰，微循环流速的定量测试系统[D]。 浙江大学，2002 [3] Xu LM,Liu P,Liu C ,et al. Effect of extract from semen persical on experimental hepatic fibrosis. Zhongguo Zhongyao Zazhi,1994,19(8):491-494.(in chinese) 徐列明，刘平，刘成，等。桃仁提取物抗实验性肝纤维化的作用观察。中国中药杂志，1994,19(8):491-494. [4] Jamall IS ,Finelli VN, Que Hee SS. A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues Anal Biochem 1981,112(1):70-75 [5] Rao XY, Su L,Wang XX,et al.Hepatic microcirculatory disturbance contributes to the pathophysiological basis of viral hepatitis. Yixue Wenxuan,1984,3(1):17-27(in chinese) 饶娴宜，苏涟，王秀霞，等。肝微循环障碍是病毒性肝炎发病原理的病理生理基础。医学入选， 1984,3(1):17-27 [6] Zhou Y,Gu J,Xu LM.Effects of Salvianolic acid B on elevated portal pressure and hepatic endothelin-1 level in rat model of hepatocirrhosis. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Xiaohua Zazhi,2007,15(1):4-7.(in chinese) 周杨，顾杰，徐列明。丹参酚酸B盐对肝硬化大鼠门静脉高压及肝组织中内皮素-1的影响。中国中西医结合消化杂志。2007,15(1):4-7. （收稿日期：2008-10-08） （本文编辑：黄建荣）
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